Com o objetivo de garantir aos fiéis setubalenses um melhor serviço religioso, o Arcebispo de Lisboa D. Fernando instituiu, a 14 de março de 1553, através da Carta de Desmembração e Separação, a criação de duas novas paróquias. Assim nasciam as paróquias de Nossa Senhora da Anunciada e de São Sebastião, esta última por separação da paróquia de Santa Maria.
Então com 361 fogos habitacionais, São Sebastião englobava o arrabalde de Palhais, o bairro das Fontaínhas, as Hortas e a Mouraria, nomeadamente as ruas compreendidas entre o Postigo do Ouvidor e a Porta da Vila.
A sede da paróquia foi estabelecida na Ermida de São Sebastião, situada no atual Largo dos Defensores da República, mais conhecido como Largo do Miradouro. Neste templo ficou até 1821, data em que foi mudada para a Igreja da Nossa Senhora da Boa Hora (Igreja dos Grilos) e em 1835 transitou para a Igreja do Convento de S. Domingos, entretanto extinto, onde ainda se encontra na atualidade.
A primitiva Ermida de S. Sebastião, que havia tido grandes remodelações no século XVII e remodelada no século XVIII, ficou muito abalada com o terramoto de 1755, não conseguindo, apesar das obras feitas, escapar à ruína, sendo demolida entre 1849 e 1857, por ordem da Câmara Municipal.
Entre a segunda metade do século XVI e finais do século XVIII, a freguesia recebeu instituições religiosas de grande importância. O primeiro foi o Convento de S. Domingos, fundado em 1563, de que se mantém a igreja de estrutura quinhentista, reconstituída após 1755, e algumas das estruturas conventuais.
O Colégio dos Jesuítas, que foi criado em 1655 e ampliado em 1703, e que se encostou ao lado exterior da muralha, levando ao entaipamento da Porta dos Apóstolos, foi ocupado, depois da expulsão da Ordem dos Jesuítas, por Freiras Bernardas e adaptado a palácio burguês no século XIX.
Do século XVIII data o Convento de Santa Teresa, da Ordem de Santo Agostinho, edifício que depois da extinção das ordens religiosas foi ocupado pelo primeiro liceu municipal do País.
Foi numa casa da Rua de S. Domingos, desta paróquia, que nasceu em 1765 o poeta Manuel Barbosa du Bocage.
